| LA GLOMERULOESCLEROSIS FOCAL Y SEGMENTARIA (GEFS) ES UNA ENFERMEDAD RENAL QUE PUEDE SER IDIOPATICA, PRODUCIDA POR MUTACIONES GENETICAS O SECUNDARIA AñoTRAS CONDICIONES O PATOLOGIAS. SE CARACTERIZA MORFOLOGICAMENTE POR LA PRESENCIA DE ALGUNOS GLOMERULOS CON ESCLEROSIS SEGMENTARIA Y CLINICAMENTE POR PROTEINURIA. EN EL AÑO 2005 DOS PUBLICACIONES DESCRIBIERON UNA FORMA FAMILIAR DE GEFS, DONDE ALGUNOS MIEMBREOS HEREDABAN UNA MUTACION EN EL GEN DEL CANAL DE CALCIO TRPC6 EN FORMA AUTOSOMICA DOMINANTE. EL OBJETIVO DE ESTA TESIS FUE DESARROLLAR UN MODELO MURINO DE NEFROPATIA EN RATONES TRANSGENICOS MEDIANTE LA SOBREEXPRESION EN PODOCITOS DE TRPC6 SILVESTRE Y MUTANTES ASOCIADAS A GEFS. POR OTRO LADO, SE PRETENDIO PROBAR EL ROL CENTRAL DEL PODOCITO EN LA ETIOLOGIA DE GEFS CAUSADA POR EL CANAL TRPC6. PARA DETECTAR LA PROTEINA TRANSGENICA SE AÑADIO UN EPITOPE DE HEMAGLUTININA (HA) EN EL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL DEL TRPC6. SOBRE EL CDNA DE TRPC6-HA SE INDUJERON LAS MUTACIONES P111Q Y E896K. LA EXPRESION Y LOCALIZACION SUBCELULAR SE DETERMINO POR WESTERN BLOT E INMUNOFLUORESCENCIA, RESPECTIVAMENTE. LOS CDNA DE TRPC6-HA SILVESTRE Y LAS MUTANTES FUERON SUBCLONADOS RIO ABAJO DEL PROMOTOR DE PODOCINA Y MICROINYECTADOS EN CIGOTAS CBA/JXC57B6/J6 PARA GENERAR RATONES TRANSGENICOS. LOS FUNDADORES FUERON GENOTIPIFICADOS POR PCR Y LUEGO SE CRUZARON CON C57B6/J6 PARA EXPANDIR LAS LINEAS TRANSGENICAS. EN RATONES F2 SE DETERMINO EL NUMERO DE COPIAS POR SOUTHERN BLOT Y LOS NIVELES DE EXPRESION DEL TRANSGEN POR PCR DE TIEMPO REAL. EL FENOTIPO SE ANALIZO MEDIANTE EL MONITORIEO DE PROTEINURIA/ALBUMINURIA Y TINCIONES DE PAS/MASSON. POR LA TECNICA DE RT-PCR SE EVALUO LA PRESENCIA DE MOLECULAS ASOCIADAS A PODOCITOS (WT-1, GLEPP1) EN LAñoRINA DE RATONES WILD TYPE Y TRANSGENICOS. LOS PLASMIDOS GENERADOS EXPRESAN LAS PROTEINAS TRPC6-HA SILVESTRE, TRPC6-HA P111Q Y TRPC6-HA E896K, SIN DIFERENCIAS EN ABUNDANCIA RELATIVA, LOCALIZACION SUBCELULAR Y PESO MOLECULAR. SE HAN GENERADO 6 LINEAS TRANSGENICAS QUE SOBREEXPRESAN DE MANERA TEJIDO ESPECIFICA LAS PROTEINAS TRPC6-HA SILVESTRE, P111Q Y E896K, INDEPENDIENTEMENTE. EL ANALISIS DEL FENOTIPO RENAL INDICA QUE LA SOBRE-EXPRESION DE TRPC6 ES SUFICIENTE PARA CAUSAR UNA GLOMERULOPATIA CONSISTENTE CON LA GEFS DESCRITA EN HUMANO, CARACTERIZADA POR PROTEINURIA, ALBUMINURIA Y LESIONES GLOMERULARES COMO LA HIALINOSIS PERIHILIAR Y EL COLAPSO GLOMERULAR. EN ORINAS DE RATONES TRANSGENICOS PROTEINURICOS SE DETECTARON MOLECULAS ASOCIADAS A PODOCITOS, GLEPP1 Y WT-1, PERO NO SE POSEE SUFICIENTE EVIDENCIA PARA PROPONER EL MECANISMO SUBYACENTE EN LA ETIOPATOGENIA DE LA NEFROPATIA. EN RESUMEN, LOS RESULTADOS INDICAN QUE LA SOBREEXPRESION EN PODOCITOS DE TRPC6 EN SU FORMA SILVESTRE O MUTADA, PROVOCAN UNA NEFROPATIA CONSISTENTE CON LA GEFS DESCRITA EN HUMANOS, CON PERDIDA DE PODOCITOS. |