| CK1 ES UNA SERINA/TREONINA QUINASA QUE HA SIDO AMPLIAMENTE DESCRITA EN LA MAYORIA DE LOS ORGANISMOS EUCARIOTAS Y ENCONTRADA UBICUAMENTE EN TODOS LOS TIPOS CELULARES ESTUDIADOS. POSEE AFINIDAD POR SUSTRATOS ACIDICOS FOSFORILANDO GRAN VARIEDAD DE ELLOS TANTO IN VIVO COMO IN VITRO. ESTA ENZIMA RECONOCE AMINOACIDOS PREVIAMENTE FOSFORILADOS O DE NATURALEZA ACIDICA EN LA POSICION -3 O -4 RESPECTO DE LA SERINAño TREONINA BLANCO DE CK1 (SP/TPXXS/T O (D/E)N=3-4XXS/T; X= CUALQUIER AMINOACIDO). A ESTAS SECUENCIAS SE LAS HA DENOMINADO CANONICA NO JERARQUICAño CANONICA, RESPECTIVAMENTE. SIN EMBARGO, EXISTEN OTROS SUSTRATOS CUYO RECONOCIMIENTO DEPENDE DE LA SECUENCIA SLS LOCALIZADA 2 A 5 AMINOACIDOS PREVIOS A UN CUMULO ACIDICO HACIA EL CARBOXILO TERMINAL (SLSXXXX(D/E)N=3-5). ESTA SECUENCIA SE HA DENOMINADO NO CANONICA. CK1 PARTICIPA EN LA REGULACION DE MUCHOS PROCESOS CELULARES COMO EL CICLO CELULAR, EL TRANSPORTE DE PROTEINAS, APOPTOSIS, VIA DE TRANSDUCCION DE SEÑALES, PROFIFERACION CELULAR, ENTRE OTROS. ESTO LA HA RELACIONADO CON EL DESARROLLO O PROGRESION DE CIERTAS ENFERMEDADES COMO EL CANCER Y PROCESOS NEURODEGENERATIVOS. ESTA ENZIMA POSEE UNA IDENTIDAD DE SECUENCIA MENOR AL 20 POR CIENTO COMPARADA CON CUALQUIER OTRA QUINASA DE EUCARIOTA (EPKS), POR LO QUE SE ENCUENTRA FORMANDO POR SI SOLA UNO DE LOS SIETE GRANDES GRUPOS (SUBFAMILIAS) EN LOS QUE SE DIVIDEN LAS QUINASAS EUCARIONTES (EPKS). ESTA SUBFAMILIA ESTA FORMADA POR SOFORMAS QUE SON CODIFICADAS POR DISTINTOS GENES: CK1ALFA, CK1Y1, Y2, Y3, CK10 Y CK1E Y POR VARIANTES DE PROCESAMIENTO ALTERNATIVO DE ALGUNAS DE ESTAS. TAL ES EL CASO DE CK1ALFA, QUIEN GENERA CUATRO VARIANTES POR LA PRESENCIAño AUSENCIA DE DOS INSERTOS (L Y S); CK1ALFA, CA1ALFAL, CK1ALFAS Y CK1ALFALS. UNO DE LOS ASPECTOS QUE MENOS SE CONOCE DE CK1 ES SU REGULACION. HASTA EL MOMENTO SE CONSIDERA QUE LOS MIEMBROS DE CK1 SON INDEPENDIENTES DE SEGUNDOS MENSAJEROS CLASICO (EJ. CAMP Y CA2+) Y SERIAN OTROS LOS MECANISMOS POR LOS CUALES CK1 ES REGULADA. VARIOS ESTUDIOS HAN ENCONTRADO QUE LA AUTOFOSFORILACION DEL EXTREMO CARBOXI TERMINAL DE CK1E Y CK1O CONDUCE A UNA INHIBICION DE SU ACTIVIDAD ENZIMATICA, PERO POCO ES CONOCIDO ACERCA DE SI ESTE MECANISMO ES COMPARTIDO POR OTRAS ISOFORMAS DE CK1. EXPERIMENTALMENTE TAMBIEN SE HABIAñoBSERVADO LA AUTOFOSFORILCION LA ISOFORMA CK1ALFA (Y DE SUS VARIANTES DE PROCESAMIENTO), SIN EMBARGO NO EXISTIAN INFORMES EN LA LITERATURA SOBRE LOS SITIOS DONDE ESTA MODIFICACION OCURRE Y LOS EFECTOS QUE PUDIERA GENERAR EN LA ACTIVIDA DENZIMATICA DE CK1ALFA Y/O DE SUS VARIANTES DE PROCESAMIENTO ALTERNATIVO. POR ELLO, EN LA PRIMERA PARTE DE ESTA TESIS ESTUDIAMOS EL PAPEL REGULATORIO DE LA AUTOFOSFORILACION DE ESTAS ENZIMAS. MEDIANTE LA EXPRESION Y PURIFICACION DE ENZIMAS RECOMBINANTES, PUDIMOS DETERMINAR QUE CK1ALFA, CK1ALFAS Y CK1ALFAL SE AUTOFOSFORILAN DURANTE SU EXPRESION EN E. COLI. ESTA AUTOFOSFORILACION PRODUCE UN RETARDO EN LA MIGRACION EN GELES DE SDS-PAGE QUE ES ELIMINADO CUANDO LAS ENZIMAS SON PREINCULBADAS CON FOSFATASA. TAMBIEN ENCONTRAMOS QUE LA AUTOFOSFORILACION IN VITRO DE ENZIMAS QUE FUERON PREVIAMENTE DESFOSFORILADAS CON FOSFATASA SERIA MENOS EFICIENTE QUE LA QUE OCURRE DURANTE SU EXPRESION EN E. COLI, ADEMAS, DEMOSTRAMOS QUE EN PRESENCIA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE UN PEPTIDO SUSTRATO DE CK1, ESTA AUTOFOSFORILACION SE VE APRECIABLEMENTE REDUCIDA. A PARTIR DE LA PREINCUBACION CON ATP (AUTOFOSFORILACION) EN AUSENCIA DE SUSTRATOS FOSFORILABLES, Y POSTERIOR ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS (MS), SE PUDIERON DETERMINAR SITIOS DE AUTOFOSFORILACION ENCK1ALFA, CK1ALFAL Y CA1ALFAS, TODOS ELLOS LOCALIZADOS EN EL EXTREMO C-TERMINAL. CK1ALFA Y CK1ALFAL COMPARTEN LOSMISMOS CUATRO SITIOS, MIENTRAS QUE CK1ALFAS INCORPORA DOS RESIDUOS ADICIONALES INCLUIDOS EN EL PROPIO INSERTO S. NO SE OBSERVA AUTOFOSFORILACION DENTRO DEL INSERTO L. NINGUNO DE LOS SITIOS DE AUTOFOSFORILACION ENCONTRADOS EN ESTAS VARIANTES CORREPSONDEN A SECUENCIAS CONSENSO QUE CK1 RECONOCE EN SUS SUTRATOS. LA GENERACION DE MUTANTES PUNTUALES Y DE DELECION DE CK1ALFA, NOS PERMITIO CONFIRMAR QUE LOS RESIDUOS ENCONTRADOS POR MS EN EL EXTREMO C-TERMINAL SERIAN LOS PRINCIPALES SITIOS DE AUTOFOSFORILACION. RESPECTO AL PAPEL DE LA AUTOFOSFORILACION, OBSERVAMOS QUE LA DESFOSFORILACION ESTIMULA LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE CK1ALFA Y CK1ALFAS CUANDO SE UTILIZA UN PEPTIDO ESPECIFICO COMO SUSTRATO Y QUE ESTA ESTIMULACION ES MAYOR PARA CK1ALFAS QUE PARA CK1ALFA. ASIMISMO, LA INCUBACION DE ESTAS VARIANTES, PREVIAMENTE DESFOSFORILADAS, CON ATP (AUTOFOSFORILACION), CAUSA UNA INHIBICION DE SU ACTIVIDAD ENZIMATICA LA CUAL FUE MAYOR PARA CK1ALFAS QUE PARA CK1ALFA. ESTO SUGERIRIA QUE LAS VARIANTES CK1ALFAS Y CK1ALFALS QUE CONTIENEN EL INSERTO S PODRIAN ESTAR SUJETAS A UNA MAYOR REGULACION PRODUCTO DE LOS DOS SITIOS ADICIONALES DE AUTOFOSFORILACION INCLUIDOS EN ESTE INSERTO. LA ACTIVIDAD DEMUTANTES DE CK1ALFA QUE TENIAN CAMBIANDOS A ALANINA LOS SITOS DE AUTOFOSFORILACION DEL EXTREMO C-TERMINAL, NO SE VE SIGIFICATIVAMENTE AFECTADA POR LA DESFOSFORILACION O POR LA INCUBACION POR ATP. ADEMAS, ENCONTRAMOS QUE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE ESTAS MUTANTES ES APROXIMADAMENTE DOS VECES MAYOR COMPARADA CON LAS ENZIMAS QUE CONSERVAN ESTOS SITIOS DE AUTOFOSFORILACION, SUGIERIENDO LA PARTICIPACION DE LOS MISMOS EN UN MECANISMO DE AUTOINHIBICION POR AUTOFOSFORILACION. ESTUDIOS CINETICOS UTILIZANDO CK1ALFA Y UNA DE LAS MUTANTES QUE NO TIENEN LOS SITIOS DE AUTOFOSFORILACION DEL C-TERMINAL SUGIEREN QUE LA AUTOFOSFORILACION DE ESTE EXTREMO CAUSARIA UNA DISMINUCION EN LA EFICIENCIA CATALITICA (KCAT/KM) DE ESTAS ENZIMAS. LA ESTIMULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE CK1ALFA Y CK1ALFA S POR DESFOSFORILACION TAMBIEN FUE OBSERVADA UTILIZANDO SUSTRATOS CELULARES DE CK1. PARA TRES DIFERENTES SUSTRATOS ANALIZADOS ESTA ESTIMULACION FUE MAYOR PARA SUSTRATOS CONTENIENDO SECUENCIAS CANONICAS DE RECONOCIMIENTO (DARPP-32 Y 3-NSP5), QUE PARA UN SUSTRATO QUE POSEIA LA SECUENCIA NO CANONICA (BETA-CATENIANA). SIN EMBARGO, ESTO MERECE MAS ESTUDIOS USANDO UN ESPECTRO MAS AMPLIO DE SUSTRATOS DE CK1ALFA. ADEMAS, LA SOBREEXPRESION DE CK1ALFA Y CK1ALFAL EN CELULAS HEK-293T PERMITIO SUGERIR QUE ESTAS VARIANTES TAMBIEN SE AUTOFOSFORILARIAN EN CELULAS EUCARIOTAS. LAS VARIANTES DE CK1ALFA QUE POSEEN EL INSERTO L SE LOCALIZAN EN EL NUCLEO CELULAR, MIENTRAS QUE LAS QUE NO POSEEN DICHO INSERTO SON PREDOMINANTEMENTE CITOPLASMTICAS. ESTO SE DEBE A QUE EL INSERTO L POSEE UNA SEÑAL DE LOCALIZACION NUCLEAR (NLS). POR TAL MOTIVO, LA SEGUNDA PARTE DE ESTA TESIS SE BASO EN DISEÑAR ENFOQUES PARA EL ESTUDIO IN VIVO DE LA REGULACION POR LOCALIZACION SUBCELULAR. PREVIAMENTE, SE ENCONTRO QUE PKA FOSFORILA IN VITRO LA SERINA 164 DE CK1ALFAL. ESTA SERINA SE ENCUENTRA INMERSA EN LA SEÑAL NLS DEL INSERTO O, POR LO QUE NOS PREGUNTAMOS SI LA FOSFIRILAICON EN ESTE SITIO TAMBIEN OCURRIA IN VIVO Y SI LA MISMA PUDIERA TENER ALGUN EFECTO EN LA LOCALIZACION NUCLEAR DE CK1ALFAL. EN ESTE TRABAJO UTILIZAMOS UN ANTICUERPO QUE RECONOCE ESPECIFICAMENTE LA FOSFOSERINA 164 DE CK1ALFA L Y MEDIANTE EL USO DEL MISMO NO PUDIMOS DETERMINAR SI PKA FOSFORILARIA IN VIVO A CK1ALFAL EN ESE SITIO. SIN EMBARGO, ENCONTRAMOS QUE CK1ALFA L S164A, UNA MUTANTE DE CK1ALFAL QUE TIENE SUSTITUIDA LA SERINA 164 POR ALANINA, SE LOCALIZA EN EL NUCLEO CELULAR, SUGERIENDO QUE ESTE RESIDUO NO ESTARIA INVOLUCARADO EN LA LOCALIZACION NUCLEAR DE ESTA VARIANTE. TAMBIEN ESTUDIAMOS LA FOSFORILACION IN VIVO DE OTROS SUSTRATOS. MEDIANTE LA UTILIZACION DE SIRNA ESPECIFICO PARA CK1ALFA ENCONTRAMOS QUE ESTA VARIANTE ESTARIA INVOLUCRADA EN LA FOSFORILACION IN VIVO DE UNA PROTEINA CITOPLASMATICA DE ROTAVIRUS (NSP5). LA HIPERFOSFORILACION NSP5 SE VIO DISMINUIDA EN PRESENCIA DEL SIRNA PARA CK1ALFA, EVENTO QUE ESTARIA RELACIONANDO ALGUNAS ALTERACIONES OBSERVADAS EN ESTRUCTURAS ENCARGADAS DE LA REPLICACION VIRAL (VIROPLASMAS). AUNQUE NO PUDIMOS DETERMINAR LA PARTICIPACION DE CK1ALFAL EN LA FOFORILACION IN VIVO DE NSP5 O EN LA FORMACION DE VIROPLASMAS, OBTUVIMOS INDICACIONES DE QUE ESTA VARIANTE SE MANTIENE EN EL NUCLEO CUANDO SE FORMAN LOS VIROPLASMAS. PARA CONTINUAR CON EL ESTUDIO DE LA REGULACION POR LOCALIZACION SUBCELULAR, SE GENERARON PROTEINAS QUIMERAS ENTRE MOLECULAS DE GFP Y UN PEPTIDO SUSTRATO ESPECIFICO PARA CK1. ESTAS QUIMERAS TUVIERON LOCALIZACION SUBCELULAR NUCLEO-CITOPLASMA ESPECIFICA, Y ACTUAN COMO SUSTRATOS IN VITRO PARA CK1. LAS MISMAS PODRIAN SER UTILIZADAS COMO SUSTRATOS ARTIFICIALES PARA ESTUDIAR LA ACTIVIDAD IN VIVO DE CK1 LOCALIZADA EN EL NUCLEO O CITOPLASMA CELULAR. |