| LA LINEA CELULAR MULTIPOTENCIAL P19 SE INDUCE A DIFERENCIARSE AL LINAJE NEURONAL O MUSCULAR CON LA FORMACION DE AGREGADOS CELULARES, LLAMADOS NEUROESFERAS (NF) Y LA PRESENCIA DE ACIDO RETINOICO (AR) O DIMETILSULFOXIDO (DMSO), RESPECTIVAMENTE. LUEGO DE LA INDUCCION DE LA DIFERENCIACION, LAS NF SEMBRADAS EN PLACAS ADHERENTES Y EXPRESAN MARCADORES DE NEURONAS MADURAS O DE COMPROMISO MIOGENICO. LAS CELULAS P19 INDIFERENCIADAS EXPRESAN LA CONEXINA 43 (CX43) Y CANALES DE UNIONES EN HENDIDURA (CUH) FUNCIONALES. LAS CONEXIONES SON PROTEINAS QUE FORMAN CUH Y HEMICANALES (HCS-CS), LOS QUE COMUNICAN EL CITOPLASMA DE UNA CELULA CON EL DE LAS CELULAS EN CONTACTO O CON EL ESPACIO EXTRACELULAR, RESPECTIVAMENTE. DURANTE LA DIFERENCIACION NEURONAL, LA CX43 DISMINUYE PROGRESIVAMENTE HASTA DESAPARECER EN LAS NEURONAS. LOS CUH SON PERMEABLES A IONES Y PEQUEÑAS MOLECULAS COMO ATP, Y SEGUNDOS MENSAJEROS COMO CA2+ E IP3, Y DURANTE LAñoNTOGENIA SE ENCUENTRAN AMPLIAMENTE DISTRIBUIDAS EN LAS CELULAS DEL SISTEMA NERVIOSO. SUS FUNCIONES SE DESCONOCEN, PERO SE LES POSTULA UN PAPEL EN LA ADQUISICION DEL COMPROMISO NEURONAL, DIFERENCIACION REGIONAL, CRECIMIENTO Y GUIA DE AXONES Y FORMACION DE SINAPSIS. POR SU PARTE, LOS HCS TAMBIEN PUEDEN ESTAR FORMADOS POR PANEXINAL (PX1), QUE PERTENECE A UNA FAMILIA DE PROTEINAS SIN HOMOLOGIA CON LAS CXS EN SU SECUENCIAS AMINO ACIDICA. LA PX1 Y LA CX43 SON ABUNDANTEMENTE EXPRESADAS POR LOS PRECURSORES DE LAS CELULAS DEL SISTEMA NERVIOSO, PERO SUS POSIBLES FUNCIONES COMO HCS AUN SE DESCONOCEN. EL OBJETIVO GENERAL DE ESTA TESIS FUE EVALUAR EL PAPEL DE LA CX43 EN LA NEUROGENESIS. PRIMERO SE EVALUO SI CNTF, UNA NEUROCITOQUINA QUE AFECTA LA DIFERENCIACION NEURONAL Y QUE AUMENTA LA EXPRESION DE LA CX43 EN ASTROCITOS, PROMUEVE LA DIFERENCIACION NEURONAL EN LAS CELULAS P19. EL CNTF AUMENTO LOS NIVELES DE LA CX43, LA COMUNICACION INTERCELULAR MEDIADA POR CUH Y LA ADQUISICION DE COMPROMISO NEURONAL, PERO NO SE DETECTO EL MARCADOR NEURONAL NEUN. LUEGO SE ESTUDIO SI LA EXPRESION SOSTENIDA DE LA CX43 ALTERA LA DIFERENCIACION NEURONAL EN LAS CELULAS P19. PARA ESTO, SE REALIZO UNA TRANSFECCION ESTABLE DE LA DNC DE LA CX43 EN LAS CELULAS P19 (P19-CX43). DESPUES DE 48 H DEL TRATAMIENTO CON AR, LAS CELULAS P19 Y P19-CX43 EXPRESARON EL MARCADOR DE COMPROMISO NEURONAL NESTINA, PERO EN EL DIA 4 SOLO LAS CELULAS P19 ADQUIRIERON LA MORFOLOGIA NEURONAL Y EL MARCADOR NEUN. LA EXPRESION DE LA CX43 Y EL ACOPLAMIENTO CELULAR AL COLORANTE AMARILLO DE LUCIFER DISMINUYERON SIGNIFICATIVAMENTE EN LAS CELULAS P19, NO ASI EN LAS P19-CX43 TRATADAS CON AR. LUEGO, SE ESTUDIO SI LA FUNCION DE CANAL DE LA CX43 (SIN EL CARBOXILO TERMINAL QUE INTERACTUA CON LAS VIAS DE SEÑALIZACION INTRACELULAR Y PROTEINAS DE ANDAMIO) ES SUFICIENTE PARA IMPEDIR EL PROCESO DE DIFERENCIACION NEURONAL. LAS CELULAS P19 FUERON TRANSFECTADAS CON LA CX43 TRUNCADA EN EL AMINOACIDO 257 DEL EXTREMO C-TERMINAL, (P19-CX43CT). LAS CELULAS P19 TRATADAS CON AR EXPRESARON LOS MARCADORES TEMPRANOS NESTINA Y TUBULINA BETA-III, Y LAS CELULAS P19-CX43CT EXPRESARON NESTINA, PERO NO TUBULINA BETA III. MAS TARDE, NO SE DETECTO CELULAS P19-CX43CT CON MORFOLOGIA NEURONAL O CON INMUNOREACTIVIDAD DE NEUN. SE HA SUGERIDO QUE ATP ACTUA COMO SEÑAL DE PROLIFERACION EN LOS PROGENITORES NEURALES Y QUE PODRIA SER REGULADOR NEGATIVO DE LA DIFERENCIACION. CONCORDANTEMENTE, SURAMINA (BLOQUEADOR DE LOS RECEPTORES PURINERGICOS) O LA 3+ (BLOQUEADOR DE LOS RECEPTORES PURINERGICOS DE LA FAMILIA P2X Y DE LOS HC-CS) AGREGADOS SIMULTANEAMENTE CON AR AUMENTARON SIGNFICATIVAMENTE LOS NIVELES DE NEUN. ADEMAS, MEDIANTE HPLC, SE DEMOSTRO QUE LAS NF DE CELULAS P19 LIBERAN PIRUNAS AL MEDIO EXTRACELULAR EN CONDICIONES DE AGREGACION POR 4 DIAS, Y LOS NIVELES FUERON MENORES EN EL MEDIO DE LAS CELULAS TRATADAS CON AR Y EN LAS P19-CX43CT TRATADAS O NO CON AR. CONCORDANTEMENTE, LAS NF DE LAS CELULAS P19 PRESENTARON ACTIVIDAD DE HCS, LA QUE FUE BLOQUEADA CON LA 3+, Y FUE SIGNIFICATIVAMENTE MENOR EN LAS NF TRATADAS CON AR Y EN LAS P19-CX43CT TRATADAS O NO CON AR. CONSECUENTEMENTE, SE SUGIERE QUE LA CX43-257 ACTUARIA COMO DOMINANTE NEGATIVO DE LA CX43 ENDOGENA, YA QUE ESTA ULTIMA SE DETECTO EN LA MEMBRANA MEDIANTE BIOTINILACION DE PROTEINAS DE SUPERFICIE CELULAR. YA QUE LAS CELULAS P19-CX43 TRATADAS CON AR NO SE DIFERENCIARON A NEURONAS, SE ESTUDIO LA POSIBILIDAD DE QUE SE COMPROMETAN AL LINAJE DE MUSCULO ESQUELETICO, DETECTANDOSE MYOD EN EL DIA 9 LUEGO DE LA AGREGACION, LA DIFERENCIACION MIOGENICA REQUIERE DE ATP EXTRACELULAR Y LOS HCS FORMADOS POR LA CX43 (HCS-CX43) SON UNA VIA DE LIBERACION DE ESTA MOLECULA AL MEDIO EXTRACELULAR, LA CUAL PODRIA AUMENTAR EN LAS CELULAS TRANFECTADAS CON LA CX43. ASI, EL AR EVITARIA LA DIFERENCIACION A NEURONAS, Y EN SU AUSENCIA SE FAVORECERIA LA DIFERENCIACION MIOGENICA. PARA EVALUAR SI ATP INDUCE LA ADQUISICION DE COMPROMISO MIOGENICO, LAS CELULAS P19 FUERON TRATADAS DURANTE 4 DIAS CON DMSO O ATP EN CONDICIONES DE AGREGACION CELULAR, Y LOS NIVELES DE MYOD FUERON EVALUADOS DESPUES DE 9 DIAS. EL TRATAMIENTO CON ATP AUMENTO LOS NIVELES DE MYOD SIGNIFICATIVAMENTE Y DE MANERA SIMILAR QUE EL AUMENTO INDUCIDO CON DMSO. PARA ESTUDIAR SI EL ATP INDUCE EL COMPROMISO MIOGENICO, SE USO CELULAS DE RESERVA (RC) AISLADAS DE CELULAS C2C12, UNA LINEA CELULAR MIOBLASTICA DE RATON. LAS RC, NO EXPRESAN MARCADORES DE COMPROMISO, Y SEMBRARLAS BAJO CONDICIONES DE DIFERENCIACION SE DIFERENCIAN A MUSCULO ESQUELETICO. EL TRATAMIENTO CON DISTINTAS CONCENTRACIONES DE ATP AUMENTO DE MANERA CONCENTRACION DEPENDIENTE LOS NIVELES DE MYOD, Y OATP, UN BLOQUEADOR DE LOS RECEPTORES P2X1, P2X2 Y P2X7, REDUJO EL AUMENTO ESPONTANEO DE LOS NIVELES DE MYOD. ADEMAS, MEDIANTE LA CAPTACION DE ETIDIO INDUCIDA CON ATP, SE DETERMINO QUE LAS REC POSEEN RECEPTORES P2X FUNCIONALES. LA CAPTACION DE ETIDIO INDUCIDA CON ATP FUE BLOQUEADA CON OATP U OLEAMIDA (BLOQUEADORES DE HCS). YA QUE NO SE DETECTO ACTIVIDAD DE HCS-CXS ES POSIBLE QUE LOS RECEPTORES P2X ESTEN ACOPLADOS A HCS-PZ1 Y NO A HCS-CXS. POR ENDE, LOS HC-PX1 ACTUARIAN COMO VIAS DE LIBERACION DE ATP. DE ACUERDO A ESTA INTERPRETACION, ACIDO 18 BETA- GLICIRRETINICO Y OLEAMIDA, BLOQUEADORES DE LOS CUH Y HCS, PREVINIERON EL AUMENTO EN LOS NIVELES DE MYOD, EN UN TIEMPO EN QUE LAS REC PRESENTAN HCS-PX1 Y NO CUH O HCS-CXS FUNCIONALES. FINALMENTE, SE PROPONE QUE LA CX43 INHIBE LA DIFERENCIACION NEURONAL, POSIBLEMENTE CONSTITUYENDO UNA VIA DE LIBERACION DE ATP, QUE EN CELULAS P19 PROMUEVE LA ADQUISICION DE COMPROMISO A MUSCULATURA ESQUELETICA. A SU VEZ, EL ATP, LIBERADO A TRAVES DE HCS-PX1, PROMUEVE LA ADQUISICION DEL COMPROMISO MIOGENICO EN LAS CELULAS C2C12 DE RESERVA, MEDIANTE LA ACTIVACION DE LOS RECEPTORES P2X. |