| A NIVEL CARDIACO, ALGUNAS CONDICIONES FISIOPATOLOGICAS COMO LA ISQUEMIA-REPERFUSION, INFECCIONES BACTERIANAS, PRODUCCION DE CITOQUINAS POR CELULAS DEL SISTEMA INMUNE Y EL USO DE ALGUNOS FARMACOS ANTINEOPLASICOS INDUCEN LA MUERTE DE LOS CARDIOMIOCITOS, COMPROMETIENDO SERIAMENTE LA FUNCIONALIDAD DEL CORAZON. VARIOS DE ESTOS ESTIMULOS DELETEREOS INCREMENTAN LOS NIVELES INTRACELULARES DE CIERTOS ESFINGOLIPIDOS EN LOS CARDIOMIOCITOS. ESTOS LIPIDOS FORMAN UNA FAMILIA CUYA ESTRUCTURA BASE BASE ES EL ACIDO GRADO PALMITATO JUNTO AL AMINOACIDO SERINA, Y NO EL GLICEROL. ENTRE SUS INTEGRANTES MAS CONOCIDOS ESTAN LAS CERAMIDAS, LAS ESFINGOSINAS Y LAS ESFINGOSINAS-1-FOSFATO. DEPENDIENDO DEL CONTEXO EN QUE SE GENEREN, ALGUNOS DE ELLOS MEDIAN LA MUERTE CELULAR, EN PARTICULAR LA APOPTOSIS. NUESTRO LABORATORIO HA ESTADO ESTUDIANDO LOS MECANISMOS MOLECULARES POR LOS CUALES LOS CAMBIOS OSMOLARES, PRIVACION DE NUTRIENTES Y ESTRES DE ORGANELOS AFECTAN LA VIABILIDAD DEL CARDIOMIOCITO. SIGUIENDO ESTE OBJETIVO, EN ESTA TESIS SE INVESTIGARON LOS EFECTOS DE CERAMIDAS Y ESFINGOSINAS SOBRE LA VIABILIDAD DEL CARDIOMIOCITO Y SUS CORRESPONDIENTES VIAS DE SEÑALIZACION. DE ESTA MANERA SE POSTULO COMO HIPOTESIS DE TRABAJO QUE LOS ESFINGOLIPIDOS ESTIMULAN LA MUERTE DEL CARDIOMIOCITO A TRAVES DEL INCREMENTO DE LAS CONCENTRACIONES INTRACELULARES DE CALCIO Y/O LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO. SUS OBJETIVOS ESPECIFICOS FUERON: -DETERMINAR SI LOS ESFINGOLIPIDOS INDUCEN LA MUERTE DEL CARDIOMIOCITO Y CARACTERIZAN EL TIPO DE MUERTE CELULAR - ESTUDIAR SI LOS ESFINGOLIPIDOS INCREMENTAN LOS NIVELES INTRACELULARES DE CALCIO Y/O LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO - INVESTIGAR EL MECANISMO POR EL CUAL LOS ESFINGOLIPIDOS INDUCEN LA MUERTE DEL CARIOMIOCITO. SE UTILIZO COMO MODELO EXPERIMENTAL CULTIVOS PRIMARIOS DE CARDIOMIOCITOS DE RATAS NEONATAS, LOS QUE SE EXPUSIERON A C2-CERAMIDAño SU ANALOGO INACTIVO DIHIDRO-C2-CERAMIDAño ESFINGOSINA ENTRE 0 Y 48 H. LOS RESULTADOS MOSTRARON QUE C2-CERAMIDA Y ESFINGOSINA INDUJERON TEMPRANAMENTE NECROSOS Y MAS TARDIAMENTE APOPTOSIS, REQUIRIENDOSE DE 2 Y 6 H DE ESTIMULACION PARA GATILLAR IRREVERSIBLEMENTE ESTOS PROCESOS, RESPECTIVAMENTE. C2-CERAMIDA INDUJO DISMINIUCION DEL ATP INTRACELULAR Y PROPICIO UNA CAIDA DEL POTENCIAL MITOCONDRIAL, EN FORMA DEPENDIENTE DE LA CONCENTRACION USADA COMO TAMBIEN DE LA ENTRADA DE CALCIO A LA CELULA Y A LA MITOCONDRIA, LO QUE SE EVIDENCIO CON ESTA (QUELANTE DE CALCIO EXTRACELULAR), GD3+ (INHIBIDOR NO ESPECIFICO DE CANALES CATIONICOS) O ROJO RUTENIO (INHIBIDOR DEL CANAL DE INGRESO DE CALCIO HACIA EL INTERIOR DE LA MIOCONDRIA). AL RESPECTO, C2-CERAMIDA INCREMENTO EL CALCIO INTRACELULAR, EVIDENCIADO A TRAVES DE MICROSCOPIA CONFOCAL POR UN AUMENTO DE LA FLUORESCENCIA DE LA SONDA FLUO-3. LOS RESULTADOS MOSTRARON UN PATRON CINETICO LENTO QUE FUE ELIMINADO POR EGTA, SUGIRIENDO QUE EL AUMENTO DEL CALCIO SE DEBIA A SU INGRESO DESDE EL MEDIOEXTRACELULAR. LA PRODUCCION DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO SE ESTUDIO POR ESPECTROSCOPIA PARAMAGNETICA DEL SPIN (EPR) Y FLUORIMETRIA USANDO DEMPO COMO "SPIN TRAP" Y DIHIDRO-RODAMINA123 COMO SENSOR, RESPECTIVAMENTE, EN CARDIOMIOCITOS TRATADOS CON C2-CERAMIDA POR 1 H. LOS RESULTADOS MOSTRARON QUE C2-CERAMIDA GENERO UNA SEÑAL DE PEQUEÑA INTENSIDAD EN LOS ESPECTROS DE PR, LO QUE SUGIERE LA PRESENCIA DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO EN EL SISTEMA. LOS EFECTOS DE ESTAS ESPECIES EN LA NECROSIS Y APOPTOSIS INDUCIDA POR C2-CERAMIDA SE EVALUO USANDO LOS ANTIOXIDANTES N-ACETILCISTEINA, TIRON Y TROLOX. LOS RESULTADOS SUGIEREN QUE ESTAS ESPECIES, A PESAR DE PRODUCIRSE, NO SON IMPORTANTES EN LA MUERTE INDUCIDA POR C2-CERAMIDA. RESPECTO A LA NECROSIS INDUCIDA POR C2-CERAMIDA, SE OBSERVO QUE DISMINUYO SIGNIFICATIVAMENTE A LAS 6 Y 12 H AL USAR COMPUESTOS MODULADORES DE CALCIO EGTA Y GD3+. TAMBIEN EL ACIDO FLUFENAMICO (USADO COMO INHIBIDOR DEL CANAL CATIONICO NO SELECTIVO QUE PROMUEVE EL INGRESO DE IONES A LA CELULA) Y LA MICOTOXINA FB1 (INHIBIDOR DE LA CONVERSION DE ESFINGOSINA EN CERAMIDAS DE CADENA LARGA) TAMBIEN DISMINUYERON LA NECROSIS, SUGIRIENDO QUE LA PARTICIPACION DE CANALES IONICOS Y LA POSIBLE BIOTRANSFORMACION DE C2 EN CERAMIDAS DE CADEN A PARTICIPACION DE CANALES IONICOS Y LA POSIBLE BIOTRANSFORMACION DE C2 EN CERAMIDAS DE CADENA LARGA EN ESTE PROCESO. PARA DETERMINAR LA PARTICIPACION DE LAS CASPASAS EN LA MUERTE DEL CARDIOMIOCITO SE ENSAYARON LOS INHIBIDORES DE CASPASAS GENERAL (Z-VAD-FMK) Y CASPASA-2 (Z-DVDA-FMK). NO SE OBSERVARON EFECTOS SOBRE LA APOPTOSIS O NECROSISS GATILLADA POR C2-CERAMIDA. LEUPEPTINA (INHIBIDOR DE CALPAINAS) DISMINUYO LA APOPTOSIS INDUCIDA POR C2-CERAMIDA, PERO NO LA NECROSI. ESTOS DATOS INDICAN QUE LAS CERAMIDAS INDUCEN APOPTOSIS DEL CARDIOMIOCITO EN FORMA INDEPENDIENTE DE CASPASAS. FINALMENTE, SE ESTUDIARON LOS EFECTOS DE LA ESFINGOSINA Y ESFINGOSINA-1-FOSFATO EN LA VIABILIDAD DEL CARDIOMIOCITO. LOS RESULTADOS SUGIEREN QUE SOLO LA ESFINGOSINA INDUJO MUERTE DEL CARDIOMIOCITO, CARACTERIZANDOSE POR SER DE TIPO NECROTICA Y APOPTOTICA, INDUCIR UNA BRUSCA CAIDA DEL Y SER MAS INTENSA Y RAPIDA QUE LAS CERAMIDAS. LOS AGENTES MODULARES DE CALCIO: EGTA Y GD3+ DISMINUYERON SIGNIFICATIVAMENTE LA NECROSIS, APOPTOSIS Y CAIDA DEL PRODUCIDA POR ESFINGOSINA. ESTE EFECTO PROTECTOR SE PERDIO PASADO ESTE TIEMPO (3 Y 6 H). LOS ANTIOXIDANTES N-ACETILCISTEINA, TIRON Y TROLOX NO TUVIERON EFECTOS PROTECTORES SOBRE LA MUERTE INDUCIDA POR ESFINGOSINA A NINGUN TIEMPO OBSERVADO. EN RESUMEN, LOS ESFINGOLIPIDOS C2-CERAMIDA Y ESFINGOSINA, NO ASI ESFINGOSINA-1-FOSFATO, INDUCEN MUERTE DEL CARDIOMIOCITO POR APOPTOSIS Y NECROSIS. ESTOS EFECTOS DEPENDEN DE INCREMENTOS DEL CALCIO INTRACELULAR DEPENDIENTES DE CANALES IONICOS, CAIDA DE LOS NIVELES DE ATP Y EL COMO TAMBIEN DE LA ACTIVACION DE LAS CALPAINAS. ADEMAS LA MAQUINARIA METABOLICA TRANSFORMARIA C2-CERAMIDA EN CERAMIDAS DE CADENA LARGA. EN ESTE SISTEMA AUNQUE LOS ESFINGOLIPIDOS GENERAN ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO, A DIFERENCIA DE OTROS TIPOS CELULARES ESTAS ESPECIES NO PARTICIPAN ACTIVAMENTE EN LA MUERTE DEL CARDIOMIOCITO. |