| SE ANALIZO LA ESTEREOQUIMICA DE ADICION DE CO2 AL C3 DEL FOSFOENOLPIRUVATO (PEP) CATALIZADA POR LAS CARBOXIQUINASAS FOSFOENOLPIRUVICAS (PEPCKS) DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y DE ANAEROBIOSPIRILLUM SUCCINICIPRODUCENS, UTILIZANDO UN ANALOGO FLUORADO DE PEP: (Z)-3-FLUOROFOSFOENOLPIRUVATO [(Z)-3-FPEP)]. AMBAS ENZIMAS CATALIZAN LA REACCION DE CARBOXILACION DE (Z)-3-FPEP, CON VALORES DE KM APARENTES DE 1/47 (ENZIMA DE LEVADURA) Y 1/14 (ENZIMA DE BACTERIA) CON RESPECTO A LA DEL PEP; POR OTRA PARTE, LAS KCAT APARENTES CAEN A 1/48 Y 1/67 DEL VALOR DE LAS RESPECTIVAS ENZIMAS AL UTILIZAR PEP. LA UNION DE PEP Y DE (Z)-3-FPEP A LAS CARBOXIQUINASAS MARCADAS CON PIRIDOXAL FOSFATO SE DETERMINO POR MEDIDAS DE FLUORESCENCIA. LAS CONSTANTES DE DISOCIACION DE LOS RESPECTIVOS COMPLEJOS DE CADA ENZIMA SON SIMILARES, LO QUE SUGIERE QUE LA DISMINUCION EN LOS VALORES DE KM AL EMPLEAR (Z)-3-FPEP ES CAUSADA POR EFECTOS CINETICOS. ES POSIBLE QUE LOS BAJOS VALORES DE KCAT APARENTE SE DEBAN A QUE LA PRESENCIA DE UN ATOMO DE FLUOR EN EL C3 DESPLACE LA DENSIDAD ELECTRONICA DEL DOBLE ENLACE HACIA EL FLUOR, LO QUE PODRIA AFECTAR EL ATAQUE NUCLEOFILICO DE LA DOBLE LIGADURA DEL (Z)-3-FPEP SOBRE EL CO2. SE ENSAYO UNA MEZCLA DE ISOMEROS DE (Z)-: (E)-3-FPEP DE 65:35 PARA DETERMINAR SI EL ISOMERO E ES SUSTRATO DE LA ENZIMA DE LEVADURA, ENCONTRANDOSE QUE ESTA CARBOXIQUINASA NO LO UTILIZA. PROBABLEMENTE POR LA DISTINTA DISPOSICION ESPACIAL DE ESTE SOMERO EN EL SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA. LA ESTEREOQUIMICA DE LA REACCION DE CARBOXILACION DEL (Z)-3-FPEP SE DETERMINO ACOPLANDO A LA REACCION CATALIZADA POR LAS CARBOXIQUINASAS LA REACCION CATALIZADA POR LA DESHIDROGENASA MALICA, Y ANALIZANDO LOS PRODUCTOS POR RMN DE 19F. SE ENCONTRO PRODUCCION SOLO DEL (2R,3R)-3-FLUOROMALATO, LO CUAL INDICA QUE LA REACCION DE CARBOXILACION OCURRE POR LA CARA 2-SI DEL (Z)-3-FPEP. ESTOS RESULTADOS SON IGUALES A LOS ENCONTRADOS PARA PEPCKS DEPENDIENTES DE GTP (ROSE, I. A. Y COLS. (1969) J. BIOL. CHEM. 244, 6130-6133; HWANG, S. H. Y NOWAK, T. (1986) BIOCHEMISTRY 24, 5590-5595), LO QUE IMPLICA QUE, INDEPENDIENTEMENTE DE LA ESPECIFICIDAD POR EL NUCLEOTIDO, LAS PEPCKS CATALIZAN LA ADICION DE CO2 POR LA CARA 2-SI DE PEP. |