| METALES TRAZA COMO ZN2+ Y CU2+ SON ESENCIALES EN LA FUNCION Y ESTRUCTURA DE DIVERSAS PROTEINAS. MAS AUN, ESTOS METALES SON ALMACENADOS EN VESICULAS Y LIBERADOS AL ESPACIO SINAPTICO DONDE MODULAN LA ACTIVIDAD DE DIVERSOS CANALES IONICOS. LOS RECEPTORES IONOTROPICOS P2X SON ACTIVADOS POR ATP, Y SE EXPRESAN EN DIVERSOS TEJIDOS. SE HAN IDENTIFICADO SIETE SUBTIPOS DE ESTOS RECEPTORES, SIENDO P2X4 EL MAS AMPLIAMENTE DISTRIBUIDO EN EL SNC. UNA DE LAS CARACTERISTICAS DE LOS RECEPTORES, SIENDO P2X4 EL MAS AMPLIAMENTE DISTRIBUIDO EN EL SNC. UNA DE LAS CARACTERISTICAS DE LOS RECEPTORES P2X ES QUE SU ACTIVIDAD ES MODULADA POR METALES DIVALENTES. EL RECEPTOR P2X4 RESULTA ESPECIALMENTE ATRACTIVO EN ESTE CONTEXTO PUES MIENTRAS EL ZN2+ POTENCIA LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR, EL CU2+ LA INHIBE. EN ESTA TESIS ME PROPUSE IDENTIFICAR AMINOACIDOS INVOLUCRADOS EN LA MODULACON PORZN2+ Y CU2+ EN EL RECEPTOR P2X4. PARA ESTO MUTARON RESIDUOS ESPECIFICOS UBICADOS EN EL ECTODOMINIO DEL RECEPTOR, ESPECIFICAMENTE EN EL FRAGMENTO THR123-THR146, YA QUE EN ESTA ZONA SE IDENTIFICO PREVIAMENTE QUE HIS-140 ES UN RESIDUO CLAVE PARA LA INHIBICION POR CU2+. LAS MUTANTES GENERADAS SE CARACTERIZARON ELECTROFISIOLOGICAMENTE POR EXPRESION HETEROLOGA EN OOCITOS DE X. LAEVIS. LA MUTANTE C132A FUE RESISTENTE A LA POTENCIACION INDUCIDA POR ZN2+, INCLUSO ESTE METAL INHIBIO, DE MANERA CONCENTRACION-DEPENDIENTE, LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ATP MIENTRAS QUE EL CU2+ LAS INHIBIO DE MANERA SIMILAR AL RECEPTOR NATIVO. D138A RESULTO RESISTENTE A LA INHIBICION INDUCIDA POR CU2+, MIENTRAS QUE EL ZN2+ POTENCIO DE MANERA SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR QUE EN EL RECEPTOR NATIVO. ESTOS RESULTADOS PERMITEN DISTINGUIR CLARAMENTE LA EXISTENCIA DE DOS SITIOS ALOSTERICOS PARA METALES EN EL ECTODOMINIO DEL RECEPTOR P2X4. UNO ES UN SITIO POTENCIADOR AL CUAL SE UNAE ZN2+ Y DEL CUAL ES PARTE CYS-132 Y EL OTRO UN SITIO INHIBIDOR EL CUAL UNE CU2+ Y ALTAS CONCENTRACIONES DE ZN2+ Y DEL CUAL FORMAN PARTE ASP-138 E HIS-140. LAS MUTANTES D129A, D131A Y T133A TAMBIEN PRESENTARON DIFERENCIAS MENORES EN CUANTO A LA MAGNITUD DEL EFECTO DE ZN2+ Y CU2+ CON RESPECTO AL RECEPTOR NATIVO. USANDO RECEPTORES CONCATENADOS P2X4, QUISE ESTIMAR LA CONTRIBUCION DE LAS SUBUNIDADES AL SITIO INHIBITORIO CON RECEPTORES QUE LLEVABAN LA MUTACION H140A EN UNA, DOS O LAS TRES SUBUNIDADES QUE FORMAN EN CANAL FUNCIONAL. LOS RESULTADOS SUGIEREN QUE UN SITIO INHIBITORIO FUNCIONAL ES SUFICIENTE PARA RETENER GRAN PARTE DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIAñoBSERVADA EN EL RECEPTOR NATIVO. ADEMAS, ME PROPUSE IDENTIFICAR UN TERCER SITIO ALOSTERICO SENSIBLE A HG2+, METAL QUE TIENEN EFECTOS SIMILARES AL CU2+ EN LOS RECEPTORES P2X2 Y P2X4, PERO NO EJERCE SU ACTIVIDAD A TRAVES DE LOS RESIDUOS EXTRACELULARES IDENTIFICADOS PARA EL CU2+ USANDO QUIMERAS P2X4/2, SE DETERMINO QUE EL SITIO SENSIBLE A HG2+ ESTA EN EL DOMINIO INTRACELULAR DEL RECEPTOR P2X2A, ESPECIFICAMENTE EN UNA SECUENCIA DE 69 AMINO ACIDOS UBICADA EN EL SEGMENTO C-TERMINAL, AUSENTE EN LA VARIANTE DE SPLICING P2X2B. ESTOS ESTUDIOS INDICAN QUE CYS-430 ES RESPONSABLE DE LA POTENCIACION POR HG2+, YA QUE C430A ES RESISTENTE AL EFECTO DEL METAL. ADEMAS, SE OBSERVO QUE EL PEROXIDO DE HIDROGENO (H2O2) Y OTROS AGENTES QUE GENERAN ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO AUMENTAN LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ATP EN EL RECEPTOR P2X2A, PERO NO EN P2X2B NI EN LA MUTANTE C430A, POR LO QUE CYS-430 PODRIA CONSTITUIR UN SENSOR REDOX INTRACELULAR DEL RECEPTOR P2X2A. EN RESUMEN, SE IDENTIFICARON Y CARACTERIZARON DOS SITIOS ALOSTERICOS EXTRACELULARES PARA METALES TRAZA DEL RECEPTOR P2X4 Y ADEMAS SE IDENTIFICO UN SENSOR REDOX INTRACELULAR EN EL RECEPTOR P2X2A. ESTOS HALLAZGOS SUGIEREN LA IMPORTANCIA DE LOS METALES TRAZA COMO MODULADORES ALOSTERICOS DE LA EXITABILIDAD NEURONAL. |