| LOS BASIDIOMICETES COMO PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM SON UN GRUPO DE HONGOS FILAMENTOSOS CAPACES DE DEGRADAR LA LIGNINA, UN BIOPOLIMERO DE ESTRUCTURA Y COMPOSICION ALTAMENTE COMPLEJA, PRESENTE EN LA PARED CELULAR DE LAS PLANTAS LEÑOSAS. DURANTE LA DEGRADACION DE LA LIGNINA ESTOS MICROORGANISMOS SECRETAN AL MEDIO EXTRACELULAR DIVERSAS ENZIMAS OXIDATIVAS, LAS QUE ESTAN INVOLUCRADAS EN EL PROCESO LIGNINOLITICO. ESTAS ENZIMAS DE MANERA INESPECIFICA, GENERAN RADICALES LIBRES A PARTIR DE LAñoXIDACION DE RESIDUOS AROMATICOS DE LA LIGNINA, PROVOCANDO LA RUPTURA ESPONTANEA DEL ESQUELETO CARBONADO DE ESTA POLIMERO. UNA DE LAS ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA LIGNINOLISIS ES UNA FENOL OXIDASA CONOCIDA COMO LACASA, PROTEINA PERTENECIENTE A LA FAMILIA DE LAS OXIDASAS MULTICOBRE. AUNQUE LA INSPECCION DE LA BASE DE DATOS DEL GENOMA DE P. CHRYSOSPORIUM REVELO LA PRESENCIA DE 5 SECUENCIAS QUE CODIFICAN PARAñoXIDASAS MULTICOBRE, NINGUNA DE ESTAS CODIFICA PARA UNA LACASA. CUATRO DE ESTOS GENES ESTAN AGRUPADOS EN EL GENOMA Y SE DENOMINAN DE MCO1 A MCO4. EL QUINTO GEN, CONOCIDO COMO FET3, CODIFICA PARA UNA FERROXIDASA CONVENCIONAL DE MEMBRANA. MEDIANTE ANALISIS BIOQUMICOS, ESTRUCTURALES Y FILOGENETICOS SE DEMOSTRO QUE MCO1 ES UNA FERROXIDASA EXTRACELULAR CON UNA NULA ACTIVIDAD FENOL OXIDASA, QUE DIO ORIGEN A UNA NUEVA RAMA DE LA FAMILIA DE LAS OXIDASAS MULTICOBRE, DISTINTA DE LACASAS CANONICAS Y FERROXIDASAS TIPO FET3. SIN EMBARGO, LA FUNCION FISIOLOGICA DE ESTA ENZIMA SE DESCONOCE. ESTUDIOS PRELIMINARES SUGIEREN UNA POSIBLE REGULACION TRANSCRIPCIONAL, DEPENDIENTE DE HIERRO Y COBRE, DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARAñoXIDASAS MULTICOBRE. A NIVEL ENZIMATICO, EXISTE EVIDENCIA QUE INDICA UNA POTENCIACION, DEPENDIENTE DE HIERRO, DE LA ACTIVIDAD FENOL OXIDASA DE MCO1. CON EL FIN DE PROFUNDIZAR EL CONOCIMIENTO SOBRE ESTA FAMILIA GENICA, EN ESTA TESIS SE DETERMINARON LOS NIVELES DE TRANSCRITO DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARAñoXIDASAS MULTICOBRE EN CULTIVOS SUPLEMENTADOS CON COBRE O HIERRO. LOS RESULTADOS OBTENIDOS PERMITIERON DEMOSTRAR QUE EL COBRE PRODUCE UN AUMENTO SOLO EN LOS NIVELES DE TRANSCRITO DE MCO1 Y MCO2, MIENTRAS QUE EL HIERRO PRODUCE UNA DISMINUCION EN LOS NIVELES DE TRANSCRITO DE MCO1, MCO2 Y MCO4. RESPECTO AL EFECTO DEL COBRE, SE VALIDO EXPERIMENTALMENTE UN SITIO DE REGULACION TRANSCRIPCIONAL PARA DICHO METAL (ACE) IDENTIFICADO EN EL PROMOTOR DE MCO1, JUNTO CON SU RESPECTIVA PROTEINA REGULATORIA (PC-ACE1). MEDIANTE ENSAYOS DE UNION PROTEINA-DNA, SE CARACTERIZO LA ACTIVIDAD DE UNION A DNA DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION MENCIONADO AL SITIO ACE, ASI COMO SU ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL IN VITRO. FINALMENTE, MEDIANTE MUTACION SITIO DIRIGIDA Y POSTERIOR EXPRESION HETEROLOGIA DE MCO1, SE ESTUDIO SU ACTIVIDAD FERROXIDASA Y SU ACTIVIDAD FENOL OXIDASA DEPENDIENTE DE HIERRO. LOS RESULTADOS PERMITIERON CONCLUIR QUE EL ACIDO GLUTAMICO 214 DE MCO1 ES UN RESIDUO CLAVE QUE PARTICIPA TANTO EN LAñoXIDACION DE HIERRO, COMO EN LA ACTIVIDAD FENOL OXIDASA DEPENDIENTE DE HIERRO. AMBAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS OCURREN EN UN UNICO SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA. |