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RESUMEN
El presente proyecto pretende desarrollar medidas de diagnóstico y control del Síndrome de la Trucha Arco Iris (Rainbow trout fry syndrome, RTFS) causada por Flavobacterium psychrophilum mediante el uso de técnicas de inmunología e ingeniería genética de vanguardia. En la primera etapa del proyecto se obtendrán aislados nacionales de este patógeno desde regiones Novena a Décima segunda con el propósito de determinar su homogeneidad tanto antigénica como también genéticas y patogénicas mediante SDS-PAGE, Wastern blot, ELISA, anticuerpos policlonales y monoclonales específicos, RFLPD (restriction fragment lengh polymorphism DNA). Esto servirá de base para la caracterización molecular de los aislados y además se utilizará para la elaboración de sondas de DNA para PCR. La caracterización de los aislantes chilenos de Flavobacterium es sin duda de vital importancia en la elaboración de un buen plan de control ya que permitirá seleccionar aquellos aislados altamente virulentos y los de mayor distribución en la población de peces, los cuales son buenos candidatos para las siguientes etapas del proyecto, particularmente aquellas que se relacionan con susceptibilidad a los desisfectantes-antibióticos y elaboración de vacunas. En la segunda etapa se incluye la evaluación de diversas formas de control quimioterapéutico y de manejo en cuanto a su eficacia para controlar brotes experimentales como naturales de la enfermedad. Inicialmente se realizarán desafíos experimentales de los peces con aislados virulentos de Flavobacterium seguido de tratamiento quimioterapéutico combinado con diferentes formas de aplicación de los mismos. La efectividad de los tratamientos se determinará mediante el test de ELISA y PCR en muestras de tejido de peces, sedimento y agua. Posteriormente, los tratamientos más efectivos se repetirán a gran escala en las empresas salmoneras que participan en el proyecto. En esta etapa se pretende además desarrollar un test diagnóstico efectivo para el creening de ovas tanto nacionales como importadas para evitar la transmisión vertical de la enfermedad. Obviamente que el desarrollo de una estrategia efectiva de desinfección y screening es el complemento ideal de las vacunas en su objetivo máximo: controlar la flavobacteriosis. La tercera etapa incluye determinar la edad óptima del desarrollo de los peces para la prevención eficiente de este tipo de enfermedad. Para ello, se analizará la respuesta inmune humoral y celular desarrollada por este grupo de bacterias en peces de diferentes edades y desafios experimentalmente con el patógeno. Se determinarán los niveles de anticuerpos circulantes y el porcentaje relativo de sobrevivencia, se determinará el mecanismo de internalización de la bacteria en las células target (Macrófago y neutrófilos) y como la bacteria logra evadir los mecanismos defensivos del huésped. En la actualidad esta información no está disponible en la literatura - los escasos resultados publicados son insuficientes y generalmente contradictorios. El conocimiento de estos fenómenos es de trascendental importancia para elaborar adecuadas estrategias de control de la enfermedad, particularmente ayudará al desarrollo de vacunas efectivas. En la cuarta etapa se identificarán antígenos bacterianos que sean capaces de proteger a los peces frente a desafíos naturales y experimentales con el patógeno virulento. Esto se realizará mediante la síntesis in vitro de factores de virulencia los cuales a menudo son altamente inmunogénicos. También se realizará inmunización pasiva y estudios de implantación, los cuales han demostrado ser muy efectivos para detectar antígenos protectores en otras especies bacterianas patógenas para peces. La quinta etapa se refiere a la identificación y aislamiento de aquellos genes que codifican para la síntesis de antígenos protectores. Para ello se construirán bibliotecas génicas en vectores de expresión procarióticos (bacterias y levaduras) y eucarióticos (células de mamíferos, insectos y peces). Estas bibliotecas serán rastreadas con anticuerpos policlonales y monoclonales previamente elaborados en la etapa 1. Se utilizará también una técnica recientemente creada denominada "Expression Library Immunization" cuyos resultados son consistentes y muy prometedores. La sexta etapa consiste en la formulación y evaluación de vacunas prototipo. Se desarrollarán vacunas del tipo bacterinas, subunidades y recombinantes. Se incluye en esta etapa diferentes estrategias de administración de las vacunas dependiendo de la edad de los peces a proteger. Se evaluará la administración por baño y oral con y sin adyuvantes (5 tipos diferentes), microencapsulación, entre otros. Al término del proyecto nos proponemos desarrollar una estrategia de control integral de la Flavobacteriosis que consista en 1) Detener la transmisión vertical de la enfermedad, 2) Adecuada estrategia de desinfección de los estanques, utensilios y personal involucrado en el cultivo de ovas y alevines y 3) Desarrollar una vacuna efectiva. |